ELISA是蛋白定量的金標準，也是免疫學研究中最常用的實驗方法之一。很多人覺得ELISA很簡單，其實不然。博深生物帶你繞開ELISA實驗中出現(xiàn)的各種問題，輕松搞定ELISA實驗~。
酶聯(lián)免疫吸附實驗
1971年瑞典學者Engvail和Perlmann,荷蘭學者VanWeerman和Schuurs分別報道將免疫技術發(fā)展為檢測體液中微量物質的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)。
酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）用于：
（1）免疫酶染色各種細胞內成份的定位；
（2）研究抗酶抗體的合成；
（3）顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應；
（4）定量檢測體液中抗原或抗體成份。
優(yōu)點：快速、靈敏、定性、定量、定位
實驗原理
1.包被：抗原/抗體，固相化
2.反應： 1)待測抗體/抗原； 2)酶標抗原/抗體
3.洗滌：使結合在固相上的抗原抗體復合物與未結合的分離
4.底物顯色：定性/定量分析
常用的酶與底物：
酶底物顯色測定波長辣根過氧化物酶horseradish peroxidase,HRP鄰苯二胺（OPD）橘紅色492nm四甲基聯(lián)苯胺（TMB）黃色450nm堿性磷酸酶alkaline phosohatase,AP4-硝基酚磷酸鹽(p-NPP)黃色405nm終止液：2mol/L H2SO4
常用方法
1.間接法
檢測抗體最常用的方法, 主要用于對病原體抗體的檢測。
優(yōu)勢：二抗可以加強信號，而且有多種選擇能做不同的測定分析。不加酶標記的一級抗體則能保留它最多的免疫反應性。
缺點：交互反應發(fā)生的機率較高
2.雙抗體夾心法
檢測大分子抗原最常用的方法。
優(yōu)勢：高靈敏、高專一性，抗原無須事先純化。
缺點：抗原一定得擁有兩個以上的抗體結合部位。
3.競爭法
檢測小分子半抗原（藥物、激素等）。
優(yōu)勢：可適用比較不純的樣本，而且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性很高。
缺點：整體的敏感性和專一性都較差。
常見問題分析
Q1.標曲不顯色或顯色很弱，樣本顯色
溶解標準品以及倍比稀釋時，未渦旋震蕩或不夠充分。
標準品溶解、倍比稀釋時均需要渦旋震蕩以保證充分混勻。單純依靠移液器反復吹打，效率較低、效果也不一定最佳。
Q2.標曲和樣本均不顯色
在孵育階段靜置在桌面上，這樣非常不利于抗原抗體之間的充分接觸，導致顯色偏弱。
推薦孵育階段，使用ELISA專用的微孔板振蕩器，調至合適的頻率，使抗原抗體充分接觸，保證結合效果。如果排除上述原因，有可能是漏加了某個組分，如檢測抗體、酶等。對于比較馬虎的新手，一定要做好標記和記錄，或者使用添加染料的ELISA試劑盒。
Q3.標曲顯色，樣本不顯色
當樣本中目的蛋白濃度極低或者樣本中干擾因素較強，就無法檢測到。目前ELISA仍然是蛋白檢測靈敏度最高的方法，與不同技術結合后，衍生出了多種類型的ELISA，提高了檢測靈敏度。
對于目的蛋白濃度特別低的樣本，可以嘗試用高敏ELISA，但這也并不意味著一定能檢測到樣本濃度，只能說可以提高樣本的可測率，并使結果更加可靠。因為通常用普通ELISA檢測的樣本OD值都偏低，而高敏ELISA可提高樣本OD值，使之盡量位于標曲范圍內，得到的數(shù)值也更加可信。
Q4.標曲和樣本都顯色，但復孔的CV大
這個問題就跟移液器和實驗者的操作有關了。移液器的使用維護不規(guī)范，就會造成移液的誤差較大；實驗者自身的操作習慣、加樣的一致性對復孔的CV也有很大影響。
掌握移液器的正確使用和維護。關于個人的操作可練習移液動作、加快速度，確保移液的精密度。
Q5.本底偏高，樣本值測不到
標曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(對于高敏ELISA可以適當放寬要求)。尤其是樣本值特別低的時候，本底過高會掩蓋目的信號，導致無法測到樣本值。
在加入TMB顯色后，需實時觀察標曲顯色情況。通常在S5孔有肉眼可見的微弱藍色，即可終止反應。
Q6.樣本經不同梯度稀釋，計算得到的樣本值差異較大
有時候我們不清楚樣本中目的蛋白的濃度如何，應該如何稀釋，那么我們就會做下預實驗，確定稀釋倍數(shù)。然而有時候同一樣本做了幾個不同梯度稀釋后，計算得到的樣本值之間差異較大，應該選擇哪一個稀釋倍數(shù)呢？
這里涉及到了基質效應。通常血清樣本加樣量較高時，血清中的各種蛋白會抑制抗原抗體的接觸，基質效應較明顯。而經過稀釋后，干擾因素也隨之稀釋，影響就會較小。當某兩個梯度稀釋后，計算得到的樣本值接近時，我們就可以認為在該稀釋梯度時，樣本中的干擾因素影響較小，計算得到的值也是接近真實的。然而這樣的稀釋是針對目的蛋白濃度較高的樣本而言。對于濃度很低的樣本，經過多倍稀釋后，就更加測不到了，此時可按照廠家說明書推薦的加樣方式操作。
Q7.不同試劑盒中的組分能否通用
除非是公用的試劑如洗液、檢測緩沖液，其它組分不建議用其它試劑盒的組分，甚至是同一指標不同批次的試劑盒里的組分。這些組分(包括標準品、標準品稀釋液、檢測抗體、酶等)都是經過優(yōu)化的，如果貿然使用其它試劑盒的組分，有可能對結果產生影響。
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